PCR、qPCR、dPCR、RT – PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR如何区分？

自从PCR技术被浪出来：PCR传奇史：“浪”出来的生物技术，经历了飞速的发展和技术更新，新冠的洗礼，让所有人都了解到了“核酸检测”的技术。

然而，对于初学者来说，PCR技术的名称和原理往往令人感到困惑，傻傻分不清。某个小伙伴尝试给让你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT - PCR 、RT-qPCR、Real-Time PCR之间的区别和联系。

如果你已经完全分清了，建议继续：多重PCR——病原体检测体系设计原则

1. 普通PCR(就是只做核酸的扩增哦！！！)

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），即一代PCR，是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其原理类似于DNA的天然复制过程，在体外条件下以指数级速度扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。PCR由变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）三个基本反应步骤构成：

①变性：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成为单链。这一步骤通常在94℃至95℃的高温下进行，持续30秒至1分钟，确保双链DNA完全解离。

②退火（复性）：当温度降低时，引物与模板DNA中互补的区域结合成杂交分子。退火温度通常低于引物本身的变性温度，一般在50℃至65℃之间，持续30秒至1分钟，确保引物与模板DNA特异性结合。；

③延伸（Extension）：在DNA聚合酶、dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸）和Mg2+等存在下，DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。延伸温度通常在70℃至75℃之间，持续时间根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度而定。

图1  PCR的基本反应原理

如果想用于核酸的检测，其实还需要进行凝胶电泳的辅助。所以很多人认为的第一代PCR，其实更应该像是凝胶电泳技术，而不是PCR技术本身！！！

经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代：普通PCR技术（PCR+凝胶电泳）、实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及数字PCR（dPCR）技术。

第一代PCR主要缺点：容易发生非特异性扩增和假阳性结果；检测耗时长，操作繁琐；

只能做定性检测。目前，在临床检测中普通PCR已经成为测序等检测技术的前处理方法，没有太多的独立应用空间。在食品药品等检测和分型中，还是不少国家标准的检测技术（毕竟标准的变革不宜那么频繁！！！要加把劲了，跟上新技术。）

2.实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法：SYBR Green法和TaqMan探针法。

①荧光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料，它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就会在过程中与双链DNA结合，从而产生荧光信号。因此，反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比，荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确，因此可能产生假阳性的结果。

优点：价格相对较低；使用方便；检测灵敏度高。

缺点：检测特异性较低，可能产生假阳性结果；无法进行多重【打印本页】【关闭窗口】