敲除长非编码RNA的利器——LncRNAway

长非编码RNA（lncRNA）被定义为长度超过200个核苷酸的RNA转录物，通常不具有编码蛋白质的能力。根据GENECODE V30版本，已注释出16193个lncRNA基因和30369个lncRNA转录产物。过去十年的研究表明，lncRNA在各种生物学和病理过程中扮演着至关重要和多功能的角色。然而，这些已注释的lncRNA中只有一小部分进行了功能性研究。
在过去几年中，已经推出了几种基于网络的sgRNA设计工具，如CRISPOR、E-CRISP、CRISPick、CRISPR-ERA和CHOPCHOP等。这些网络工具致力于计算不同Cas蛋白的CRISPR-KO/KI、CRISPRa/i的sgRNA。然而，它们更多关注优化sgRNA筛选方法，从而提高特异性和减少脱靶效应。虽然像CRISPR-ERA和CRISPick这样的工具可以生成用于抑制lncRNA的sgRNA，但它们采用的算法倾向于针对蛋白编码基因。由于这种方法会去除大片段的DNA，因此可能会导致非特异性敲除。
在5月13日上线的Nucleic Acids Research杂志中，重庆市人民医院吕青研究员、清华大学深圳国际研究生院张雅鸥教授合作发表了题为 LncRNAway: a web-based sgRNA design tool for precise and effective suppression of long noncoding RNAs 的论文。

该文章报道了LncRNAway（https://www.lncrnaway.com），这是一个集成了靶向分支点-3’剪接点（BESST）和敲除启动子和第一外显子（PE1）方法以及siRNA设计工具的在线服务器（图1）。该工具旨在简化研究lncRNA功能前的基因编辑方案生成。用户可以选择来自Ensembl数据库的人类或小鼠的lncRNA，或输入新注释的lncRNA的位置信息并选择不同的Cas蛋白（SpCas9、Nme2Cas9、SaCas9）。网络工具允许用户选择BESST、PE1或RNAi算法，实时计算sgRNA或siRNA序列并进行手动优化。此外，LncRNAway还提供了优化的引物，用于进行QPCR和基因分型PCR并根据DNA序列位置绘制基因编辑的模式图（图2）。因此，LncRNAway可以帮助用户轻松地在几分钟内设计敲除lncRNA的sgRNA。
图2. LncRNAway网站首页
图2. LncRNAway的工作示意图
综上，本文基于lncRNA的loss-of-function (LOF) 方法结合检测引物设计开发了LncRNAway，旨在为研究人员提供一个简化的、一站式的lncRNA敲除/敲降指导。此外，LncRNAway可用于设计sgRNA库，用于筛选在特定生物学或病理过程中的功能性lncRNA。总之，LncRNAway提供了一个准确快速的sgRNA设计平台，有效加速了CRISPR-Cas9技术在长非编码RNA功能研究中的应用进程。
本文的第一作者是重庆市人民医院博士后张世宽，通讯作者是重庆市人民医院吕青研究员。清华大学深圳国际研究生院张雅鸥教授为共同通讯作者。

论文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38738626/

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae383/7670902?login=false