DNA聚合酶具有5'至3'外切核酸酶活性。这种活性是指酶可以切除DNA链上的5'末端核苷酸。例如，DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ，简称polⅠ）和其他多种在原核生物及真核生物中发现的DNA聚合酶都具有这种特性。
另外，Taq DNA聚合酶在体外也表现出5'至3'外切核酸酶活性，尽管在PCR反应中，由于引物的存在及其结构以及PCR条件的限制，聚合酶的外切酶活性不会导致引物被切掉。
链接：Taqman探针原理
Taqman探针又称为水解探针、双标记探针。水解探针5’端和3’端标记两种不同荧光团的寡核苷酸。通常报告基团位于5’端，淬灭基团位于3’端。
当探针保持完整时，淬灭基团通过荧光共振能量转移抑制报告基团的荧光发射。它的作用机制依赖于 Taq DNA聚合酶的 5’-3’核酸外切酶活性。
PCR过程中，引物与DNA模板配对，同时DNA聚合酶随着引物进行延伸，当酶延伸至探针杂交位置时，DNA聚合酶5’-3’核酸外切酶活性切割探针，探针释放出报告基团，引起荧光增加。
在该系统中，荧光是在延伸阶段测量的，与扩增的特异性产物量成正比。
实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。
将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。
在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光(如上图所示),
随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中基因模板的个数呈负相关)。
例1 新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。
（1）首先，从样本中提取病毒RNA，经__________酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
（2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图1）。
① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火时，通过______________________ 原则而特异性结合。
②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_________（正相关或反相关反）关系。
（3）通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就_________。
③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_________
(4)阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________。
a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值
答案：（1）逆转录；（2）碱基互补配对原则 正相关；（3）Taq酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降等 越小 阳性 （4）abc
Taqman水解探针具有高度的灵敏性和特异性，能够有效区分不同的靶基因。其设计过程相对简单，可以根据需要选择不同的荧光染料和寡核苷酸序列，以满足不同实验目的的需求。同时，该技术还具有快速、准确的特点，能够在较短的时间内得到大量的实验数据，为研究工作提供有力的支持。
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