焦磷酸测序技术（第二代DNA测序技术）是DNA 序列分析技术,该技术无需进行电泳,DNA片段也无须荧光标记,操作极为简便。该测序方法需在同一反应体系中发生由四种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中只加人一种dNTP,若该dNTP 与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链的3'端并释放等量的焦磷酸基团(PPi)。PPi可转化为可见光信号,并最终转化为一个峰值。每个峰值高度与反应中掺人的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后,再加入下一种dNTP,继续下一轮DNA链的合成。整个测序反应分为四步。

    1)将一个特异性的测序引物和单链DNA 模板结合，然后加入四种酶的混合物，包括 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶及双磷酸酶。反应的底物有腺苷-5'-磷酸硫酸（APS）和荧光素。

    2)向反应体系中加入一种dNTP,如果它刚好能和DNA 模板的下一个碱基配对,则会在 DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的3'末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。dATP由腺苷-α硫-三磷酸替代,因为 DNA聚合酶对dATPαS的催化效率远高于dATP 的催化效率,且dATPαS不是荧光素酶的底物。

   3)在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和 APS结合形成ATP。生成的ATP在荧光素酶的催化下,又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过电荷耦合器光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

   4)反应体系中剩余的dNTP 和残留的少量ATP在双磷酸酶的作用下发生降解。

   5)上述是一种dNTP反应的四个步骤,接下来加入另一种dNTP,使重复进行第2~4步反应,根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信息