肺炎链球菌转化实验的9个科学问题

1 肺炎球菌、肺炎链球菌与肺炎双球菌是一回事吗

人教版高中生物学旧教材将本实验称为“肺炎双球菌的转化实验”，新教材则标以“肺炎链球菌的转化实验”。实际上,1944年艾弗里发表的文章中采用的名称为“ pneumococcal types”，翻译为“肺炎球菌类型”)，因此，“肺炎双球菌”和“肺炎链球菌”指同一种细菌。目前，在人类医学上多称其为“肺炎链球菌”或“肺炎球菌”2，而在引起动物疾病方面仍存在“肺炎双球菌”的叫法。肺炎双球菌的名称由来是因为肺炎链球菌的菌体呈矛头状、常成双排列。

显微镜下的肺炎球菌↑

2 S型肺炎链球菌的致病机理是什么

在抗生素发明之前，肺炎是导致人类死亡率最高的疾病之一，主要的致病因素就是带荚膜的肺炎链球菌( Pneumococcus)。带荚膜的肺炎链球菌的致病性与其细胞壁上的一层多糖荚膜有关，该多糖荚膜对细菌具有保护作用，可使其逃避人体吞噬细胞的破坏，从而迅速增殖，且引起肺泡组织发生变化，致使人类发病或死亡。带荚膜的肺炎链球菌在培养基上可生长形成表面光滑的菌落，因此被称为S型(Smoh一词字首)。而另一类不致病的R型肺炎链球菌不具备荚膜，可以被机体的免疫系统摧毁，因此不会导致机体发生疾病，在培养基上会形成表面粗糙的菌落，被称为R型( Rough一词字首)。除了表面光滑与粗糙区别之外，S型细菌菌落更大,易与R型菌落区分。

3 S型细菌向R型细菌转移的DNA仅仅是荚膜合成相关基因吗

1928年，英国微生物学家格里菲斯错把经过加热的S型菌液当成注射液佐剂，连同未加热的R型菌液混合后注射给小鼠，发现小鼠患败血症死去，并在小鼠体内分离得到S型细菌，证实S型细菌具有使R型细菌转变为S型细菌的转化因子。

20世纪40年代，美国微生物学家艾弗里通过一系列实验，结合数学中的“筛法”，依次提取S型细菌无细胞提取液中的蛋白质、脂类、多糖、DNA、RNA等，最后发现将DNA去除后的提取液无法使R型细菌转化成S型细菌，并通过DNA酶(可以降解DNA的酶)处理这种提取液，最终证实了引起细菌转化的因素来自S型细菌的DNA。那么，S型细菌向R型细菌转移的到底是什么DNA?在小鼠体内分离到的S型细菌是什么时候形成的?

同高等生物一样，细菌也有遗传性状，如形状颜色、大小、抗性、营养代谢缺陷等，均由细菌的遗传物质包括环状主染色体(称拟核，类染色体)以及游离的环状微小染色体(即质粒，除主染色体之外的染色体)上相应的基因控制。如使S型细菌具有“致病性”这一性状的根本原因是S型细菌中与荚膜形成相关的基因。S型细菌向R型细菌转移的DNA位于哪一种遗传物质上呢?已有研究表明，基本所有类型的肺炎链球菌荚膜多糖合成基因均位于染色体上dexB和aliA基因之间，可以确定S型细菌向R型细菌转移的是其主要染色体上的DNA。

那么，S型细菌向R型细菌转移的仅仅是荚膜合成相关基因吗?实际上，在肺炎链球菌的转化过程中，完全的荚膜性状、一系列的中间型荚膜性状、M蛋白性状、青霉素抗性等也得到了转化，而且性状都是独立转化的。因此，肺炎球菌实验中转化的不仅是编码荚膜性状的基因，还包括控制其他性状的基因。

结合艾弗里的实验可以确认，当格里菲斯错把经过加热的S型菌液当成注射液佐剂，连同未加热的R型菌液混合后，实际上此时已经完成了DNA的转化，从第4组小鼠体内分离到的S型细菌，就是由R型细菌转化形成的S型细菌。即注射给小鼠的就是新形成的S型细菌，DNA转化发生在注射前而不是小鼠体内。

4 S型细菌转移的DNA在R型细菌体内的状态是什么

从S型细菌转移到R型细菌的荚膜合成相关基因及其他基因DNA在R型细菌中是什么样的状态?是整合到R型细菌的主染色体上还是以游离状态存在呢?由于被转移的是位于S型细菌主染色体上的DNA，应是以线性DNA形式转入B型菌，如果没有与DNA复制相关的DNA序列，则不具备自主复制的能力。因此，S型细菌的DNA与R型细菌的DNA应该发生了整合(重组)，才使荚膜基因得到表达。

DNA整合的基础是具备相似的序列。已知艾弗里实验中的R型细菌(R36A)来源于S型细菌变异，因此可以断定来自S型与R型细菌DNA组成存在非常高的相似性；来自S型细菌的DNA与R型细菌的基因组DNA发生了遗传重组，这时可以将S型细菌称为“供体”，R型细菌称为“受体”。

5 S型细菌的DNA如何被转移到R型细菌体内

从格里菲斯的实验可以看出，错将S型细菌(液)加热当成注射液佐剂，可以使S型细菌中的蛋白质变性，酶结构因破坏而失活，S型细菌不再具有增殖能力。那么DNA如何进入到R型细菌体内呢?艾弗里指出：R型细菌须处于一种能够接受转化刺激的活化时期。细菌的活化时期，是生长早期且旺盛生长的对数期。在液体培养条件下，R型细菌才可以吸附一定数目的DNA并将其转入细胞内；因此当R型细菌与S型细菌的DNA接触时，R型细菌表面有吸附DNA的位点，可将其DNA吸附并转入到体内。艾弗里还指出，接种量过大时转化反而不易成功。

DNA需要具备一定长度，才能与细菌表面的受体结合，当表面受体位点饱和后，将阻止其他双链DNA的结合。当S型细菌的DNA被吸附到R型细菌表面受体位点上后，就会“穿入”到R型细菌内，进而发生遗传重组，具体过程是：(1)核酸外切酶或者DNA移位酶( translocase)降解其中的条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条DNA链拉进细胞中，这个过程是不可逆的；(2)进入R型细菌的单DNA与受体DNA配对，由于S型细菌和R型细菌DNA序列相似性很高，因此两者配对的程度很高，转化的可能性也很大；(3)单链供体DNA与受体DNA发生对应位点的置换，从而发生遗传重组，供体DNA被保留在受体菌内，即R型细菌具备了S型细菌的部分性状。

6 S型细菌加热温度是多少

教材并未指出采用多高的温度处理S型细菌，其实，当时格里菲斯采用了60℃和65℃的加热温度。非常幸运，这是一个未将S型细菌加热到足以使其DNA变性(DNA双链中的氢键打开)的温度(当时一般采取不超过70℃的加热方式将细菌杀死)；而且艾弗里为谨慎起见，将S型菌液加热温度由60℃升高到65℃，确实发现此时S型细菌失去使R型转化的能力，不过这个温度仍然不足以使DNA变性，而会使细菌培养液中某些成分失活，如使兔血清中破坏转化的酶失活。

还有一种说法认为，格里菲斯和艾弗里的加热温度可能会使DNA变性，即能使DNA双链间的氢键断裂使其解旋为单链，但是也会在短时间内复性(解链的DNA恢复为双链)，这种说法得到一些中学教师的认可。不过，从目前常用的PCR技术来看，使DNA氢键打开的温度应该高于72℃(该温度为DNA双链延伸的温度)，有些PCR引物的退火温度高达65℃(引物与DNA模板相结合的温度)。因此，艾弗里采用的温度可以使细菌内的蛋白质变性并使其失去增殖能力，破坏培养液中抑制转化的成分，但遗传物质DNA并未受到影响。

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