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在新人教生物学必修二第三章第一节DNA是主要的遗传物质这一节中，几个经典的实验是高中生学习的重点内容，实验的设计思路也有利于提升学生的思维能力。人教版课本对于肺炎链球菌的体内体外转化实验、赫尔希和蔡斯的噬菌体侵染细菌的实验介绍地详细具体，而对于烟草花叶病毒侵染实验介绍地很简单，该实验是证明核酸是遗传物质的关键一环。若仅根据课本上的两行文字去理解这部分内容，学生很容易对这部分知识产生疑惑。在浙科版生物学必修二教材中，对于该实验着墨较多，但也没有详细的操作过程。
1 人教版课本对烟草花叶病毒侵染实验的叙述及学生可能存在的疑惑
“从烟草花叶病毒中提取的蛋白质，不能使烟草感染病毒，但是，从这些病毒中提取的RNA，却能使烟草感染病毒。”对于这样的文字，学生很可能就认为—直接用烟草花叶病毒的蛋白质和RNA分别去感染烟草。但事实是烟草花叶病毒的蛋白质和RNA分开后，病毒就不完整，就不再具备生物学活性，何谈去感染烟草呢？有学生可能会根据前面的噬菌体侵染细菌实验的设计思路推测到直接用烟草花叶病毒的蛋白质和RNA分别去感染烟草是不可行的。但烟草花叶病毒的侵染实验是如何操作的，学生也存在着困惑。
2 烟草花叶病毒侵染实验的真相
烟草花叶病毒侵染实验是将烟草花叶病毒的DNA和蛋白质相互分离并进行体外重建。
（1）分离烟草花叶病毒的蛋白质和RNA
研究者们使用苯酚或碱性洗涤剂处理将烟草花叶病毒的蛋白质和DNA分离。Gierer 和 Schramm 在进行烟草花叶病毒的感染实验时，采用将烟草花叶病毒置于水和苯酚（石碳酸）中，而将蛋白质和 RNA 相互分离。其基本操作是将烟草花叶病毒溶液与苯酚的水溶液混合，并将此液配制成含有3%的十二烷基硫酸钠(SDS)和 0.3 mol/L的醋酸钠溶液。在4℃下剧烈振荡，离心后取水相，即可得到烟草花叶病毒的RNA。
Fraenkel-Conrat H.和 Williams R. C.在进行烟草花叶病毒的重建实验时，先将烟草花叶病毒用弱碱性洗涤剂处理，然后用提纯的方法将烟草花叶病毒的RNA和蛋白质相互分离。其基本操作是，在 39℃条件下，将烟草花叶病毒溶液置于pH值为 10~10.5 的甘氨酸缓冲液或 pH值为 10.5 的碳酸氢盐缓冲液中透析 48~72 h。用冷超速离心法分离除去未降解的病毒，用硫酸铵将上清液调至pH值为0.4的饱和液并再次离心。离心后烟草花叶病毒的蛋白质主要存在于沉淀中，而RNA主要存在于上清液中。对蛋白质部分进行重新溶解，经在低硫酸铵浓度下沉淀、透析等操作后可获得纯度高、重组效果好的烟草花叶病毒的蛋白质。
从碱降解的烟草花叶病毒中提取的核酸组分，其重组效果不如用洗涤剂法提取的核酸组分。洗涤剂法提取核酸的基本操作是，将含有1%的 SDS的病毒溶液的pH值调整为8.5，并在40℃下保持16~20 h。用硫酸铵使蛋白质沉淀后，取上清液。将上清液冷藏、离心，并用冷乙醇和pH值为5的乙酸盐进一步纯化。可获得重建效果好的烟草花叶病毒的RNA。
（2）将烟草花叶病毒提纯后的蛋白质和RNA进行体外重建
烟草花叶病毒结构简单，是一种典型的棒状植物病毒，约由2130个相同的蛋白亚基沿着单链RNA螺旋状而成，有较强的自组装特性。但体外重建的效果受pH值和离子强度等因素的影响。Fraenkel-Conrat H. 和 Williams R. C.在进行重建活性病毒时的基本操作是，将1%蛋白质溶液与0.1%核酸溶液按一定比例混合，并添加适当的缓冲液，使样品呈现乳白色。将样品置于3°C环境下保存24 h后进行超速离心，除去不可溶物质，获得乳白色上清液。即可从乳白色上清液中获得有活性的重组病毒。用电子显微镜观察，最终形成的重组烟草花叶病毒的形态与正常烟草花叶病毒相同。
盛国跃. 关于"烟草花叶病毒的感染和重建实验"的几个疑惑点探析[J]. 生物学通报 2021年56卷2期, 36-38页, ISTIC CA, 2021:浙江省教学研究2019年度重点课题"基于学业质量标准的高中生物学试题命制的实践研究". |