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高中生物学抗体特异性检测作为高中生物学选择性必修模块3中的重要内容，单克隆抗体的制备涉及细胞融合技术的应用，而单克隆抗体本身也在生物医学领域具有广泛的应用。因此，单克隆抗体的制备及应用常作为考查学生生物学学科核心素养的载体。学生在学习这一内容时，往往对抗体检测的具体过程产生疑惑，如何证明杂交瘤细胞分泌的抗体能与特定抗原也就是目的蛋白特异性结合呢?
抗体作为基础科学研究和临床检测中最常用也是最重要的工具之一，确保抗体的特异性和稳定性引起了科研工作者的关注。由多个抗体研究和应用领域的领导者组成的国际抗体验证工作组(InternationalWorkingGroupforAntibodyValidation，IWGAV)致力于优化抗体的使用和验证标准。2016年，在《自然·方法》期刊上发表了关于验证抗体特异性策略的提议［1］，首次提出了系统性的抗体验证方案。笔者基于此方案，结合抗体生产领域占有较大份额的赛默飞世尔科技、CellSignalingTechnology(CST)的抗体验证方案进行归纳整理，得出抗体检测的五种支柱策略。
1基因策略(GeneticStrategies)
通过ＲNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统，构建出目的蛋白表达减少甚至敲除的细胞。通过基因测序确认敲低、敲除的情况，或蛋白质组分析验证表达水平的变化。然后通过蛋白质印迹法、免疫组织化学等实验检测抗体特异性。在这种策略中，基因敲除或敲低的细胞中，目的蛋白的表达下降显著甚至没有表达，因此在实验中检测到的信号强度应当大幅下降甚至没有，如果信号强度变化不大，则表示该抗体特异性不强，出现了与其他蛋白质的结合。该策略将基因和目的蛋白、抗体之间建立了直接的联系，是证明抗体特异性的有效方法。不同的抗体生产公司均认可并使用这一策略，只是称呼不同，例如赛默飞世尔科技称为敲除和敲低抗体验证，而在CST抗体验证原则中叫作二元模型。
2正交策略(OrthogonalStrategies)
利用不需要使用抗体的方法(基于基因组学、转录组学、蛋白质组学数据预测或质谱方法测定等)对多个样本中的目标蛋白进行含量测定，选择含量存在差异的样本进行抗体标记并测定。特异性高的抗体，其标记量应与目标蛋白含量存在相关性。赛默飞世尔科技采用的相对表达抗体验证、细胞处理抗体验证也是相同的思路。
3独立抗体策略(IndependentAntibodyStrategies)
本策略使用两种及以上识别同一目的蛋白的不同抗体进行蛋白表达量的测定。这里所谓的“独立”，是指所使用的抗体与目的蛋白的不同区域结合，也就是识别不同的抗原表位。因而，可以大大降低独立抗体与相同的无关蛋白进行结合的概率。通过对多个表达量存在差异的样本同时进行独立抗体的检测实验，进行对比及可靠性统计分析，从而评价这些抗体的特异性。
4标签融合蛋白策略(ExpressionofTaggedProteins)
通过基因工程的方法，在细胞系中表达融合有标签肽段的目的蛋白。这个标签可以是FLAG、V5或荧光蛋白如绿色荧光蛋白等。在检测时，使用标签肽段的抗体检测并表征目的蛋白的含量，与待检测抗体的检测结果进行比较，两者应呈现出一致性。IWGAV在文中提示，由于抗体的检测结果取决于目的蛋白的浓度，因此标签融合蛋白的表达量不应该过高，否则将掩盖非特异性结合的结果;同时还应该避免标签肽段对目的蛋白细胞定位或空间结构、蛋白质活性的影响。CST抗体验证原则的异源策略中的重组蛋白法与此类似。
5免疫捕获—质谱联用策略(ImmunocapturefollowedbyMassSpectrometry)
通过免疫沉淀从混合溶液中捕获能与抗体特异性结合的蛋白质，利用质谱分析与抗体结合的目的蛋白氨基酸序列。由于免疫沉淀可能会将抗体、目的蛋白甚至与目的蛋白结合的其他蛋白质一起分离出来，因此还可以获取与目的蛋白结合形成复合物的其他蛋白质。尽管质谱分析可以准确获得蛋白质的氨基酸序列，但是这种策略无法区分该氨基酸序列是来源于直接和抗体结合的目的蛋白，还是结合于目的蛋白的其他蛋白质。
除了上面提到的五种支柱策略以外，还可以通过亲和力检测、抗原表位定位、肽段芯片验证结合位点等多种验证方法，也可以提供抗体的其他生化和免疫特征。但是，IWGAV认为这些方法都不能直接测定抗体的特异性及是否出现交叉反应，因此不能取代上述五种支柱策略。考虑到五种策略各有其最适合的使用场景或使用限制，IWGAV建议抗体的使用者至少进行其中一种验证策略，如果能够进行多种验证策略则更佳。五大支柱策略中涉及科学探究与科学思维中的实验组与对照组的设置、加法原则与减法原则、假说演绎法等，也可以作为提升学生生物学学科核心素养的载体。
主要参考文献
［1］UHLENM，BANDＲOWSKIA，CAＲＲS，etalT．Aproposalforvalidationofantibodies［J］．NatureMethods，2016，13(10):823-827．
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