【推荐阅读】目的基因是否导入受体细胞的检测

来源:仪征中学 时间:2023-05-26
 
检测目的基因是否导入受体细胞的方法主要有以下几种:

1.载体表型选择法

基因工程中使用的载体往往会携带选择性标记,最常见的是携带一个或多个抗生素的抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。受体细胞本身对某种抗生素是敏感的,在含有该抗生素的培养基上无法生长;当携带该抗生素抗性基因的载体转入受体细胞后,受体细胞可以在含有该抗生素的培养基上生长,从而达到筛选的目的。需要注意的是,这种方法只能检测载体是否成功转入,其中可能包括自身环化的载体,所以要确定目的基因是否真的转入,还必须借助其他筛选方法。

β-半乳糖苷酶显色反应选择法,即我们常说的蓝白斑筛选法,也是一种常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上含有LacZ基因,其表达产物为无活性的α肽段。受体细胞可以合成无活性的ω肽段。α肽段与ω肽段结合后可以产生有活性的β-半乳糖苷酶,将无色的5溴4氯3吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)水解成蓝色产物。

如果目的基因插入LacZ基因上的多克隆位点,重组载体转入受体细胞后就不能产生β半乳糖苷酶,无法将X-gal水解成蓝色产物,因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。

2.DNA电泳检测法

DNA电泳检测法是基因工程中常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。可以提取受体细胞中的质粒直接进行电泳检测,但由于含有目的基因的重组质粒分子质量一般比较大,在电泳凝胶中的迁移速率较慢,为了增加实验的准确度,可以选择合适的限制酶对质粒进行酶切后再进行电泳检测,同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目的基因。除此之外,还可以以质粒为模板进行PCR扩增,之后再进行电泳检测。

设计PCR的一对引物时,最好一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物,从而进一步增加了实验的可信度。DNA电泳检测法可以与前面介绍的载体表型选择法相结合,来快速、准确地检测目的基因是否导入受体细胞。

3.核酸杂交检测法

Southern印记杂交是核酸杂交检测法中的一种,用于对DNA分子的检测。用这种方法检测目的基因是否导入受体细胞的基本过程是:先提取受体细胞的DNA;用限制酶对DNA分子进行酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳;然后对分离后定位在凝胶上的不同分子质量的DNA进行碱变性处理,并将凝胶中变性的DNA转移至硝酸纤维素膜或其他固相支持物上固定;再用相应的带有标记的探针进行杂交、经放射自显影,就可以鉴别出目的基因。

如果需要进行大量的筛选,如基因文库的筛选,可以选用菌落原位杂交法。具体操作流程是:先将转化的菌落影印在滤膜上;然后通过溶菌和核酸变性处理,使核酸暴露并与滤膜原位结合;再用特异性的核酸探针进行杂交,经放射自显影,就可以鉴别出目的基因;最后从原来的培养基上选出相应的菌落。
 
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