新冠病毒核酸检测
1、PCR
聚合酶链式反应(PCR)是体外合成特定DNA片段的一种方法,变性、退火(复性)、聚合(延伸)三步基本程序组成一个循环,通过多次循环反应使目的DNA得以迅速扩增。PCR的关键在于引物和退火温度;反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
(1)PCR原理:DNA双链复制。
(2)条件模板:DNA母链耐高温的DNA聚合酶引物:分别与单链相应序列相结合原料:分别为dCTP、dATP、dGTP、dTTP。
(4)结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,
DNA分子就以2n的形式增加。
2、阈值循环数-Ct值
扩增的产物则需要用荧光探针来检测。荧光探针在双链DNA上结合后能够发出荧光,当扩增越来越多,探针释放的荧光也就越来越强烈,成为一个独特的荧光信号,从而判断核酸的来源。
核酸检测“Ct值”:Ct值是阈值循环数,荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。
Ct值的数值与病毒含量、传染力成反比。Ct值越高,就越安全。Ct值的数值越大,代表病毒含量较少,传染力就越弱;Ct值的数值越小,代表病毒含量较大,传染力就越强。
2、检测流程(见右上图)
(1)采样:通过鼻咽拭子等采样;
(2)灭活:通过56℃水浴30分钟;病毒没有侵染活性,但核酸依然完整;
(3)核酸提取:使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等RNA;
(4)逆转录成cDNA:逆转录cDNA合成反应需使用引物、dNTPs、逆转录酶等
(5)荧光定量PCR:荧光探针+PCR过程
(6)分析数据生成报告:阳性则确诊,阴性不一定不含有病毒。
注:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)一步法试剂进行逆转录+第一轮扩增反应。
新冠病毒抗原检测
新冠病毒抗原检测是通过抗原和抗体结合反应在试纸条上检测,方便快捷,一般15-20分钟即可出结果。但因为会有一些干扰而出现假阳性。市面上有胶体金法、荧光免疫层析法、乳胶法等。
① 若样品含新冠病毒,扩散到接合垫和抗体2结合,再检测线上和抗体1结合,胶体金显色;多余的抗体2继续扩散到质控线和抗-抗金标抗体结合,胶体金显色。故抗原阳性有两条红线。
② 若样品不含新冠病毒,金标抗体2不能直接结合抗体1,胶体金不显色;多余的抗体2继续扩散到质控线和抗-抗金标抗体结合,胶体金显色。故抗原阴性有一条红线。
七、新冠血浆抗体检测
新冠病毒抗体检测法通过检测人体中是否存在与新冠病毒特异性结合的抗体,从而间接证明人体是否已感染新型冠状病毒。
①若样品含抗体lgG,会和胶体金病毒抗原结合,在检测线与人lgG抗体一起形成复合物而显色;在质控线金标鼠lgG与其抗体结合生成复合物而显色。故阳性为2条红线。
②若样品不含抗体lgG,在检测线不能形成复合物,不显色;在质控线金标鼠lgG与其抗体结合生成复合物而显色。故阴性为1条红线。
新冠疫苗的类型
人工免疫主要采用接种疫苗的方式来进行。通过广泛的疫苗注射获得群体免疫,更人道、可控。
上图中A:衣壳蛋白;S蛋白:包膜子粒/抗原蛋白;①逆转录;②限制酶切割质粒;③目的基因与运载体重组;
④将重组质粒导入受体细胞;⑤筛选和微生物繁殖(发酵工程);⑥提取代谢产物;⑦转录;⑧获取质粒;
途径I-通过加热(病毒灭活56℃30min)或化学剂灭活;途径II-裂解病毒;
途径III-酶的分离提纯;途径IV-转录;途径V-分离质粒
疫苗I:灭活全病毒疫苗,含核酸和抗原蛋白 疫苗II:蛋白质疫苗,不含核酸仅抗原蛋白
疫苗III:蛋白质疫苗,不含核酸仅S抗原蛋白
疫苗IV:mRNA疫苗,仅含mRNA ,抗原蛋白由受体细胞(人)合成。
疫苗V:DNA疫苗,质粒载体疫苗,仅含DNA,抗原蛋白由受体细胞(人)合成。
从遗传物质角度,病毒的核酸不进入人体或者被加工后再进入人体则更安全,如蛋白质疫苗,质粒载体疫苗。
从特异性免疫角度,灭活全病毒疫苗、蛋白质疫苗仅能激活体液免疫,生成记忆B细胞;减毒病毒和mRNA疫苗,DNA疫苗能激活体液免疫和细胞免疫,生成记忆B细胞和记忆T细胞。
(考点)新冠病毒核酸检测
5-1综合题
2020 年,新型冠状病毒(一种 RNA 病毒)肺炎使全球百万人失去了生命。咽拭子核酸检测是一种快速有效在早期发现新冠病毒感染者的医学检测方法。咽拭子采样是用医用棉签从人体的咽部蘸取少量分泌物(含粘膜上皮细胞)。图 10 示核酸检测的主要流程。
(1)(3 分)采样人员必须身着防护服,主要是为了 (控制传染源/切断传播途径/保护易感人群)。对采样后至离心纯化过程的叙述,错误的是 。(多选)
A.56℃30 分钟处理的主要目的是杀灭细菌 B. |