PCR技术原理及其应用

【摘要】  聚合酶链反应（PCR）技术，是八十年代中期发展起来的新技术，它的诞生改变了分子生物学研究的指导方法。由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此，PCR技术在建立的短短几十年中，便迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域，并取得丰硕成果。

【关键词】  PCR原理，PCR技术的应用

一、PCR技术原理

PCR技术是一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法。其基本点是重复利用扩增引物，以扩增的目标序列为模板，在DNA聚合酶作用下进行体外目标序列的合成。一个循环周期包括三个步骤，即模板DNA变性，一定温度一定时间使靶序列双链解离成单链；引物与靶序列退火，一定温度一定时间使两个引物分别结合到靶序列DNA两条链的3’末端；引物延伸，引物沿靶DNA3’末端向5’末端延伸。这样三步形成一个循环，并且，前一循环的产物作为后一循环的模板，使靶序列呈指数倍数进行扩增。

1、PCR技术操作的反应体系

（1）扩增缓冲液   标准的缓冲液含10mM Tris·HCl ，pH 为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效　

（2）脱氧核苷三磷酸（dNTP）   脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。

（3）引物   在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反应体系中相当于6x1013个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 μg 的产物，足以用于常规分析。

（4）模板   模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时，一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基因有 3×105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒的 DNA 作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要 10ng，1ng，1pg 。

（5）DNA 聚合酶   Taq DNA 聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌，为单分子酶，在 75℃ 活性最强。具有 5'-3' 合成活性和 5'-3' 外切活性 , 但是无 3'-5' 外切活性。在 95℃ 的半衰期为 40 分钟。启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72℃ 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3'-5' 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配几率。

2、PCR技术操作的温度监控

在典型的反应中，90～95℃使双链DNA变性，在40～60℃下让引物与模板DNA退火，在70～75℃下用Taq聚合酶催化新链延伸。反应时间应与放大的片段长度而定，开始时模板变性时间要适当延长，最后一次循环延伸时间要保持5分钟，反应终止要立即放到4℃中或加入10mM EDTA以终止反应。

3、反应体系各组分的特异性影响

（1）模板DNA   模板可以是dsDNA、ssDNA、mDNA（逆转录为cDNA）。操作中对模板要求不高，纯度要求低，用量少，甚至可以用单个细胞的水煮裂解物。实验表明，目标片段起始量过高反而使扩增效率下降。

（2）引物   引物为人工合成。PCR技术操作要求目标片段两侧序列可知。扩增片段长度由引物决定，引物特异性决定扩增片段的特异性。一般对引物要求：①15～30bp②引物（特别是3’端）应尽量避免发夹结构③两引物避免有互补④与核算序列库其他序列无明显同源性⑤两引物的C+G%含量尽可能相似。引物设计不当则特异性差，非特异扩增产物增加，甚至不扩增出所需目标片段。

（3）Taq聚合酶   通常的聚合酶在95℃已完全变性，Taq聚合酶具热稳定性，该酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切酶活性，即不能校对错误掺入碱基。

Taq聚合酶在95℃1小时仍有40%的活力，这一特点完全适合PCR反应，其最适温度为75～80℃。其催化效率达150NT/秒/酶分子。使反应在高温下得以完成，大大降低DNA二级结构的影响，可扩增较长片段，也使模板与引物杂交专一性提高。

（4）Mg2+为Taq聚合酶所必需,但过高会影响酶活性,也影响退火等。K+可促进退火，过高也抑制酶活性。四种dNTP浓度过高将使参入错误增高。

二、PCR技术的应用

1、研究方面

PCR技术在研究方面的应用，主要是体外扩增DNA的直接序列测定；使用可直接进行化学修饰的PCR引物在PCR产物中导入所希望的变化；应用PCR、GC—夹子和变性梯度凝胶电泳测突变；稀少转录产物的快速克隆和序列测定；反向PCR扩增原来位于核心顺序两侧的DNA序列，从而产生未知序列的探针或确定上游和下游两侧区域的序列；通过PCR技术的进化分析，如mtDNA的PCR扩增及直接测定序列获得了对证实“人类mtDNA进化树的根源在非洲”这一想法有价值的资料。Thomas从保存标本的皮肤扩增m

+DNA，在DNA序列上进行了鼠类的群体研究。PCR的应用使研究对象的非创造性采样成为可能，对濒危物种的研究也有较大价值。

2、临床医学方面

遗传疾病多为基因的重排、缺失和突变。PCR技术作为基因分析手段已被应用于疾病的诊断，如镰刀状贫血病、地中海贫血症及Bart’s等的基因分析以及产前基因诊断、基因转位活化癌基因的分析、感染性治病原的检测和致病基因的检测，例如已成功地用于与AIDS相关的HIV-I的检测，并已研制成对乙肝HBV和与宫颈癌有关的HPV病毒的分析检测试剂盒。

3、分子考古、法医学、和人类学方面

DNA来源量少，如头发、血迹、单个二倍体细胞、单个精子等，可用PCR技术从中提取微量DNA做模板进行扩增，产生目标片段供分析研究。如从4万年前西伯利亚长毛象冰冻的象毛中提取DNA经PCR扩增经行分子考古。又如人的DNA中很多特定序列具有高度多态性（如HLA—D区），这些序列对每个人都是特定的，这就是DNA指纹，通过PCR技术可用于血缘关系、法医学以及人类学上的基因分析。

PCR技术的广泛应用，充分显示出其独特的优越性，但是，PCR技术本身还有待进一步完善。在扩增时，仍然存在一定频率的错配，导致扩增产物发生突变。因此，如何提高扩增产物的质量、提高反应的特异性、消除扩增平台期以及怎样快速、简便制备PCR样本都有待进一步解决。

总之，PCR技术正以强大的生命力向各个领域渗透，已经取得了很大的成就。但是就技术本身而言，需要进一步发展和完善，在实践中进一步拓展其应用领域。

总结

在遗传学实验课上，通过PCR方法测定人类性别的实验，对PCR技术有了初步的了解，但对其原理和应用范围仍存在许多不了解和疑问。于是经过查文献和资料，进一步了解了什么是PCR，PCR技术的原理，PCR在各个领域的应用价值，尤其是对生命科学产生的重大影响。

【参考文献】

1. 张经纬.聚合酶链式反应（PCR）技术. 渝西学院学报.1994，（02）

2. 叶倩. PCR技术综述. 科技创新导报〔J〕.2009，（05）

3. 马小军. PCR技术及其应用. 植物杂志.1996，（05）