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转基因抗虫棉的研究进展
摘要：综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。
关键词：转基因 抗虫 棉花 研究进展
引言
棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。与施药防治棉田害虫相比，转基因技术具有较多优势：不会在土壤和地下水中造成残留；不会被雨水冲刷流失；对非靶标生物无毒性；保护作用无盲区；减少农药及用工投入[2]等。雪花凝集素（Gulanthus nivalis agglutinin gene，GNA）是第一个转入重要作物、并对刺吸式口器害虫有抗性的基因，转GNA的水稻可降低害虫的存活率，阻止害虫的发育[3]。另外烟草阴离子过氧化物酶[4]、昆虫几丁质酶基因[5]也被用于抗虫基因工程的研究。迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域，最成功的例子是苏云金芽孢杆菌Bt杀虫基因的应用，其次是蛋白酶抑制剂基因。另外，凝集素、α-淀粉酶抑制剂、胆固醇氧化酶等转基因抗虫植物的研究也取得了进展，所以利用基因工程技术培育转基因抗虫棉受到了各国的高度重视。自1996年商品化种植转基因作物开始，全球转基因植物的种植面积已由1996年的170万hm2猛增到2008年的1.25亿hm2，增长了73倍， 2008年全球市场价值已达75亿美元，约占全球商业种子市场的22%，其市场价值优势明显，转基因产业得到了蓬勃发展，尤其在发展中国家。印度Bt棉2002年引入，连年种植面积快速增加，至2008年达760万hm2，产量翻番，曾经是全球棉花产量很低的国家，现已成为棉花出口国。转基因棉回报率高，生产成本低，市场需求大，到2005年我国通过国家审定的转基因抗虫棉品种已增至26个[6]，到2007年我国转基因抗虫棉种植面积已达380万hm2，占全国棉花种植面积的69%。农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）发布的报告显示，2007年转基因作物种植面积增加了12%，达到了1.143亿hm2，成为过去五年来种植面积增加第二快的一年。[7] 2008年至2010年，我国新型转基因抗虫棉培育和产业化全面推进，新培育36个抗虫棉品种，累计推广1.67亿亩，实现效益160亿元，国产抗虫棉市场份额达到93%，有效控制了棉铃虫危害，彻底打破了国外抗虫棉的垄断地位。这是我国转基因生物新品种培育重大专项取得的成就之一。我国转基因技术研究与应用取得了显著成效：获得一批具有重要应用价值和自主知识产权的基因，培育一批抗病虫、抗逆、优质、高产、高效的重大转基因生物新品种，为我国农业可持续发展提供强有力的科技支撑。
然而，随着转基因抗虫棉在世界范围的发展，也不断涌现出一些问题，如棉花质量问题，抗虫性持久问题，对生态环境安全问题等，本文综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。
1.几种抗虫基因的介绍
1.1 Bt基因
Bt基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因是抗虫棉中研究最多、进展最快、应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫有专一杀伤作用。大部分Bt杀虫蛋白具有杀虫专一性和高度选择性，所以对植物和包括人在内的动物没有毒害，而且是环境可以接受的。这种芽孢杆菌的杀虫特性在于它在形成芽孢时产生一种杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）或（δ-内毒素）[8,9] 转Bt基因棉的毒素能在棉株内持续表达，使得棉铃虫在棉花的整个生长期都受到Bt毒蛋白的高压选择，因而减少了农药用量约60%，减少劳动力投入7%，转基因抗虫棉花比一般棉花平均提高单产10%，扣除种子成本和价格因素，每公顷增收可达到1250元[10]Bt基因的种类很多，但获得转基因抗虫棉的Bt基因仅有Cry1A（b）、Cry1A（c）、Cry1A等少数几种。Bt基因对棉铃虫、红铃虫、玉米螟等害虫有较高的抗性。[7]天然Bt基因在转基因植物中表达很低[Vaeck et al. 1987，Fischhoff et al. 1987]，故多采用人工合成的方法对Bt基因进行改造以获得能在植物高校表达的杀虫基因。如：Perlak等[13]按照双子叶植物优化密码子，以化学合成方法合成了衍生于Bt kurstaki HD-1、Cry1A（b）和HD-73、Cry1A（c）的嵌合基因，其3´端的1/2序列被缺失，且改变了部分保守序列的密码子。所得到的基因序列包含相当于编码615氨基酸序列的1845bp。将基因导入棉花后，其中杀虫蛋白质表达量为天然Bt基因表达量的50 ~100倍。郭三堆等[14]设计并合成了适于在植物中表达的苏云金芽孢杆菌GFM crylA Bt杀虫基因，构建了可在植物中高效表达杀虫基因的表达载体pGBI4AB，通过农杆菌介导法和花粉管通道法导入棉花，研制成功了单价抗虫棉，并在1997年开始了商品化，至2001年单价抗虫棉累计推广了73.33多万hm2。美国孟山都公司也研制成功转Bt杀虫基因的抗虫棉并先于我国进行了大规模商品化。转Bt基因抗虫棉的成功研制与大面积推广和应用，促进了高科技生产商品化趋势，降低了棉农和政府的投资风险，取得了显著的生态、社会和经济效益。
1.2蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂（PI）是一类可以抑制蛋白酶水解活性的蛋白质，小到由十几个氨基酸、大到由几百个氨基酸组成。根据蛋白酶抑制剂所抑制蛋白酶的性质，可将其分为4大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属羧肽酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂。目前所发现的植物来源的蛋白酶抑制剂均属于前3种类，其中在抗虫植物基因工程中，研究最深入的是丝安酸蛋白酶抑制剂。如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，大豆胰蛋白酶抑制剂基因，马铃薯蛋白酶抑制剂I基因和II基因，番茄蛋白酶抑制剂I基因和II基因等，作为杀虫基因已被广泛而深入的进行了研究。[1]抗虫性较为理想的是豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor, CpTI) [15]。它是由设立在尼日利亚的国际热带作物研究所(IITA)从几千份豇豆资源材料中筛选到的一份抗豆象虫甲的材料——TVtrz027中得到的。[16]可抑制昆虫的消化作用，并引发一系列生理反馈作用，如干扰昆虫蜕皮过程，降低免疫功能，或使肽类激素产生不足等，最终导致昆虫死亡。[17]
Hilder等[18]及刘春明等[19]分别报道分离并克隆了CpTI的cDNA，Hilder等[Hilder V. A.，Gatehouse1987]首先获得了转cptI基因的烟草植株。李燕娥等[21]和陈宛新等[22]分别将豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTi基因和修饰过的CpTi基因导入棉花，获得了具有明显抗虫能力的转基因植株。与Bt毒蛋白基因相比．CPTI基因的抑制作用靶是昆虫酶的活性位点．具有杀虫范围广、效果稳定等特点；其次是害虫耐受性极小，因为它作用于昆虫消化酶最为保守的部位；再者，目前应用的蛋白酶抑制剂基因，主要源于植物，其转基因产品更易于公众接受。然而，蛋白酶抑制剂基因在抗虫上的问题也不容忽视，这就是它要求在转基因棉花中有较高的表达量，才能实现抗虫性；在某些情形下，还要求组织或器官特异表达。但由于PI基因往往需要大量表达才能产生明显的抗虫效果，因而转PI基因棉还没有在生产中得到推广和应用。[23]
1.3 植物凝集素基因
在抗虫植物基因工程研究中，植物凝集素也占有重要地位。植物凝集素是一类具有特异糖结合的活性蛋白，可分为7个蛋白质家族。其中4个较大的家族分别是豆科凝集素、2型核糖体失活蛋白、几丁质结合凝集素以及单子叶甘露糖结合凝集素。目前熟知的大多数凝集素都分别属于这四个家族。尤其是雪花莲凝集素（Galanthus navies agglutinin，GNA），是从石蒜科植物雪花莲中分离的甘露糖结合凝集素，实验结果表明：它有一些特殊的生物学特性。如对动物反转录病毒（包括HIV）具有抑制作用[24]，可凝聚兔血红细胞，但不能凝聚人的血红细胞；能抑制大鼠小肠中大肠杆菌的繁殖（Pusztai et al.1993）；可对棉蚜这种同翅目害虫具有控制作用。[1]
其杀虫机理即植物凝集素被昆虫摄食后会在昆虫食道中释放，与消化道围食膜上的糖蛋白结合，抑制营养物质的正常吸收；同时还可在昆虫消化道内诱发病灶，使昆虫因消化道感病而死亡。[26]
棉蚜是棉花的另一个主要害虫，随着抗棉铃虫转基因棉花的普遍种植，棉蚜的危害逐渐加重。因此，利用转基因技术获得抗蚜棉花品种已成为棉花抗虫育种的新课题。有些具有抗虫性，特别是对蚜虫等同翅目害虫有极强的抗杀作用。将来源于小麦胚芽凝集素基因导入陆地棉后，转基因T2代能显著抑制棉铃幼虫和棉蚜的生长发育[27]；菊芋凝集素基因对棉蚜也具有一定的抗性[28]。目前，国内外的研究者已开始这方面的工作，并获得了转基因植株[29]，可望在不久的将来培育出抗蚜棉花新品种。
1.4 其它抗虫基因
除Bt基因、CpTI基因被人们广泛用于抗虫基因工程外。人们还在分离克隆其他抗虫基因，如a一淀粉酶抑制基因，用于抑制糖分的消化和分解，使昆虫得不到足够的营养和能量而死亡；蝎毒素、脱皮激素、昆虫病毒等基因，使昆虫吞食转基因植物后生长发育畸形。神经肽基因，使昆虫神经调节混乱而死亡。人们在研究中还发现，在芽孢形成前的营养生长阶段，可分泌和产生一种非d-内毒素的杀虫营养蛋白，即Vip（vegatative insecticidal protein）蛋白，被称为第二代杀虫蛋白。Vip蛋白可与敏感昆虫表皮细胞、尤其是柱状细胞相结合，造成细胞崩解，伴随着肠道严重受损，使昆虫迅速死亡。胆固醇氧化酶（choleterol oxidase，Cho）基因也被称为第二代抗虫基因，其表达的产物是一类新型杀虫剂。在链霉菌属（streptomyces）、短杆菌属（Brevibacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Schizopylium）等细菌中均发现有胆固醇氧化酶。David等（1994）从streptomyces A19249中分离得到胆固醇氧化酶基因（choM）。生物测试结果表明：胆固醇氧化酶对棉铃象甲（boll weevil）及烟青虫（tobacco budworm）有明显的毒杀作用，有效作用浓度与Bt杀虫晶体蛋白类似。
另外，人们还进行核糖体失活蛋白、脂肪氧化酶、慈茹蛋白酶基因等控制基因的分离、修饰和导人棉株中的尝试，以期培育出遗传背景更具有多样性的、多种基因控制的抗虫基因工程棉。[31,32]
2.抗虫基因栽体的构建
分离得到的抗虫基因一般不能直接使用．必须对其进行分子重组和修饰，把目的的基因、启动子、报告基因。终止子及加强子等整合到合适的载体上(一般采用农杆菌Ti质粒)。其中关系到基因工程成败的是启动子。所谓启动子是指一段可与RNA聚合酶及其他一些影响转录的反式因子结合而准确有效地起始转录的DNA序列。目前，包括棉花在内的大多数植物基因工程所采用的启动子都是花椰菜花叶病毒的GMV 35s启子，它比原来广泛采用的l9s启动子的功效强50倍。另一个植物基因工程中常用的启动子是从农杆菌Ti质粒的胭脂碱(NopaIine)合成酶基因上分离出来的NOS启动子。但功效不如CaMV35s。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶(CAT)、新霉素磷酸转移酶(NeT-11)和葡萄苷酸酶(GUS)基因。
尽管有报道称．加强子在抗虫棉的基因工程中作用不显著，但研究其它参与表达调控的各种因子或元件仍受到普遍重视。另外，还有一些特定序列能提高基因的转录速率和加工效率，如一些基因表达调控的修饰序列。如Kozak（1989）发现的Kozak序列、5'UTR（从mRNA5'端转录起始位点至翻译起始位点之间的序列）和3'UTR（从mRNA的翻译终止子（UAA，UAG，UGA）下游到poly（A）的一段序列）以及W序列（一段富集TTAAC序列）等在棉花基因工程实践中，应用最多的是来源于T-DNA的nos终止子。
现已建立起以Ti质粒为基础的各种基因转移载体，如中间载体、双元载体及含有CaMV35S启动子的混台载体系统，这些载体系统的发展为各种外源基因顺利导人细胞和稳定表达创造了条件。[33]郭三堆等对35S启动子进行了改造，将Q和Kozak序列片段连接到质粒pG2E35SP上来，人工设计合成了命名为UT的多联终止密码子序列，获得重组质粒pGUT。同时在3’端加入多聚腺苷酸序列(PPSS)和3’端加工序列NGTGTTNN(其中N可代表A、T、G、C中的任何一种碱基)以提高杀虫基因mRNA的稳定性，可使基因的表达水平提高3O~6O倍。获得了定名为pGBI4AB的重组质粒。构建出植物高效表达载体pGB I 1214ABC-双价杀虫基因植物表达载体。[34]
此外，mRNA不稳定序列的存在使得mRNA不稳定，翻译效率低，从而导致外源杀虫基因在棉花中的表水平很低，故应尽量避免这些不稳定序列在基因编码区及3'端的存在。
2.抗虫基因的转化方法
植物遗传转化(及再生)是进行植物遗传操作的一个重要环节，对抗虫棉的基因工程而言，它甚至是一个制约因素。因此，建立有效的遗传转化系统是利用植物基因工程获得植物新品种的基本前提。
2.1 农杆菌质粒介导法
土壤农杆菌是一种能侵染多种双子叶植物的细菌，它体内含有一些很大的质粒，统称Ti质粒。在Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA，土壤农杆菌(Agrobacterium)有二个种：根癌农杆菌(A．tumefaciens)和发根农杆菌(A．ri．hizogenes)，。它们均能向植物细胞转移其质粒上的一段DNA即T-DNA，T-DNA上含有一些致瘤基因。使被侵染的植物产生肿瘤。即冠瘿瘤。T-DNA可整合到植物细胞核基因组中，并能稳定遗传。其方法是将植物外植体浸泡在含经修饰和组装的n 或Ri质粒的农杆菌溶液中过夜，使农杆菌侵染植物组织；然后，把外植体取出冲净置于含抗菌素的选择培养基上培养，诱导外植体再生植株。由于目的基因同时连接有抗抗菌素的选择标记基因(如NPT-II等)．凡能在选择培养基上出愈者．就表明目的基因被整合到植物细胞的核基因组中。农杆菌质粒介导法的优点在于可靠性强、效率高，但只有外植体能再生的职子叶植物才能采用。
农杆菌介导的遗传转化是目前植物基因工程研究中最常用的方法，[
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