胰岛素是一种真核细胞产生的分泌蛋白，它的合成与分泌需要内质网和高尔基体直接参与，才能对合成的蛋白质进行加工和修饰，从获得具有一定空间结构和生物活性胰岛素。而大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的蛋白质进行加工修饰。那么导入胰岛素基因的大肠杆菌是如何生产具有生物功能的胰岛素？
生产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建方案主要有下列三种：
该方法在早期重组大肠杆菌生产胰岛素时采用。A链和B链的基因编码区(不含内含子)由化学合成并分别克隆在β－半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种克隆菌分别合成β－半乳糖苷酶－人胰岛素A链融合蛋白以及β－半乳糖苷酶－人胰岛素B链融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氰在甲硫氨酸残基的C端以化学方法切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
由于β－半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸残基，溴化氰处理后生成多个小分子多肽，而A链和B链内部均不含甲硫氨酸残基，故不被溴化氰继续降解。A链和B链进一步纯化后，以2∶1的分子比混合，并进行体外化学折叠。
将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β－半乳糖苷酶基因的下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸密码子
。
该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采用溴化氰特性化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。
由于C链的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得
体外折叠率高达80%以上
。
为了获得具有生物活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C链。
胰蛋白酶的作用位点位于精氨酸或赖氨酸残基的羧基端，由于天然构象的存在，人胰岛素原链第22位上的精氨酸残基和第29位上的赖氨酸残基对胰蛋白酶的作用均不敏感。
因此用胰蛋白酶处理人胰岛素原后，可获得完整的A链以及C末端带有精氨酸残基的B链。
也就是说，与人的天然胰岛素相比，这个B链多出一个氨基酸残基，后者再用高浓度的羧肽酶B专一性切除。
该方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链的基因编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的下游。
重组子表达出的融合蛋白经溴化氰处理后，分离纯化A－B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与AB链分别表达法相似，其最大的缺陷仍是
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