农杆菌介导转化法(浙江大学)

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。

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1974年，从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒(tumorinducingplasmid)，称为Ti质粒。Ti=TIP

1977年，分子杂交技术证实肿瘤细胞中存在外源的DNA,与Ti质粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段，T-DNA(transferredDNA),其内有致瘤和冠瘿碱合成酶等基因。

1981年，发现Ti质粒上有致瘤区(virulenceregion)，Vir区。

Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75.4um，分子质量为(90－150)×106Da。在温度低与30℃的条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。

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Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外，还具有以下几种重要功能：

1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；

2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；

3、决定根癌农杆菌的寄主植物范围；

4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；

5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢。

Ti质粒的结构

来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类、胭脂碱(nopaline)类、农杆碱(agropine)类。

Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。

长度：160-250kb

6大功能区：1)致瘤区，这个区主要合成植物生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区(Vir)；6)DNA复制区(Rep)。

T-DNA

在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-DNA。

致瘤区+冠瘿碱+左右边界=T-DNA

插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。

T-DNA区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.

T-DNA：

Tms1、Tms2、Tmr这3个基因表达植物生长素和细胞分裂素，可调节植物细胞的生长和发育，它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿。

冠瘿碱合成基因在宿主植物体内合并分泌出来，被Ti质粒上的冠瘿碱代谢基因分解成碳源和氮源，供根癌农杆菌生长所需。

脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的左边界和右边界。

在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。

插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。

Vir区(Vir-region)：即毒性区。其长度约为35kb。

控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位，与感染后冠瘿形成有关。

Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点(virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG)。

vir基因控制着T-ＤＮＡ的转移。

植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮(acetosyringone，AS)和α-羟基酰丁香酮(α-hydroxacetosyringone，OH-AS)。

根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。

目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)和羟基乙酰丁香酮(OH-AS)的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。

双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T-DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。

最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。

在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。

virA基因——virG基因

virD基因产物：virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物(T-复合体)，以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。

小结：

植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮(acetosyringone，AS)和α-羟基酰丁香酮(α-hydroxacetosyringone，OH-AS)。

根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。

最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。

在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。

其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。

VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物(T-复合体)，以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。

T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞壁及细胞膜。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。

T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。

T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DNA？

利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中，结果表明，在植物细胞中，单链DNA迅速转变成双链DNA分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更高。然而T-DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进入植物细胞的。T-DNA单链的5’端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA5"端的VirD2蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。VirE2蛋白质是一种单链结合蛋白质，能够包裹T-DNA单链，和其它T-DNA结合蛋白质共同构成了T-复合体。